Fleming đã thi đậu vào nơi ông muốn học. Ông luôn dẫn đầu lớp trong các môn học, nhất là các môn về miễn dịch học. Khi vừa tốt nghiệp năm 1906, ông được nhận làm phụ tá cho Almroth Wright, một người đi tiên phong trong lãnh vực vắc-xin.

Năm 1914, chiến tranh thế giới lần thứ nhất bùng nổ. Alexander Fleming buộc phải dừng công việc nghiên cứu, bị gọi nhập ngũ và phục vụ ở quân y viện ngoài chiến trường.

Trong vòng 4 năm phục vụ trong quân đội, Fleming đã chứng kiến nhiều binh sĩ không chết trên chiến trường mà lại chết trên giường điều trị của quân y viện, mà phần lớn những cái chết ấy là do vết thương bị nhiễm trùng. Điều ấy khiến ông rất buồn, và nhận ra cần phải tìm ra một chất kháng khuẩn đủ hiệu lực, để khống chế sự nhiễm trùng của các vết thương.

Sau khi chiến tranh kết thúc, Fleming được giải ngũ, ông trở lại phòng thí nghiệm ngày xưa ở Học viện Saint Mary và tiếp tục công việc nghiên cứu bỏ dở của mình.

Năm 1922, sau nhiều năm nghiên cứu không thu được kết quả đáng kể nào, thì một lần tình cờ Fleming phát hiện một đĩa petri nuôi cấy vi khuẩn mà ông vô tình hắt hơi vào, sau 3 ngày được ủ trong tủ ấm, ở đĩa cấy đó khuẩn lạc không mọc được ở chỗ có dịch từ mũi ông rơi vào. Cho rằng trong các dịch của cơ thể người tiết ra có một chất có khả năng ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn, Fleming cùng người trợ lý của mình đã lấy mẫu tiến hành thí nghiệm với nước mắt, nước mũi, nước bọt, dịch vị... của người. Kết quả đều giống nhau, chúng đều có tác dụng ức chế tương tự nhau.

Và sau đó không lâu, Alexander Fleming đã cho công bố về việc phát hiện ra một chất mà ông gọi là lysozyme, một chất do chính cơ thể con người tạo ra, có thể tiêu diệt một số vi khuẩn, nhưng theo ông thì nó không thể diệt một số vi khuẩn có hại đặc biệt với loài người.

Lysozyme là phát hiện độc đáo, nhưng vai trò kháng khuẩn không rộng, không có tác dụng trên nhiều loại vi khuẩn gây hại. Nhưng cũng nhờ phát minh này, Fleming trở nên nổi tiếng, được giới y học Anh biết đến.